实时荧光定量 PCR
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作者:proef7446
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发布时间: 1924天前
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实时荧光定量PCR技术（Real-time Quantitative PCR），是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。荧光定量PCR以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点成为了分子生物学研究中的重要工具，目前已得到广泛应用（如转基因动植物检测、RNAi基因失活率检测、病原微生物或病毒含量检测、基因差异表达、基因分型）。
实时荧光定量PCR技术（Real-time Quantitative PCR），是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。荧光定量PCR以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点成为了分子生物学研究中的重要工具，目前已得到广泛应用（如转基因动植物检测、RNAi基因失活率检测、病原微生物或病毒含量检测、基因差异表达、基因分型）。
1. 荧光定量PCR分类
TaqMan 荧光探针
PCR 扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5′-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
SYBR Green荧光染料
SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。SYBR Green法价格经济，对于常规样本的基因表达量检测，具有方便、快速、准确、重复性好的优点。赛哲拥有的强大引物库及各类型样本和基因检测方案更是为数据结果的可靠性提供了强有力的保证。但由于染料可与所有的双链DNA结合，其特异性和灵敏度较弱，因此对于一些特殊样本（如血清样本）或应用（如病毒分型、SNP检测），则推荐使用探针法。
2. 科研实例
使用探针法检测某SNP位点
某SNP位点分析结果
A. 纯合(G/G)，B. 杂合(G/T)
SNP分型散点图
SYBR Green 染料法检测人母乳中 miR-124 在不同时间的表达水平变化
扩增曲线和熔解曲线
miR-124在不同时间的表达水平变化
3. 服务内容和流程
根据基因序列设计扩增目的基因以及看家基因的引物；
提取RNA，通过A260/A280测定RNA的浓度和纯度；
将RNA逆转录为cDNA；
实时荧光定量PCR；
数据分析，实验报告整理。
4. 客户提供
待检测基因信息；
客户提供新鲜或冻存的样本。
5. 百菱生物提供
荧光定量PCR检测原始数据；
扩增曲线及溶解曲线；
结果分析。
