Western blot实验流程

目的蛋白分子量为何与实际不符？

a)翻译后修饰：蛋白发生如磷酸化、糖基化等翻译后修饰时分子量会增加；

b)翻译后剪切：蛋白发生剪切时分子量会降低，某些蛋白在合成时是作为前提蛋白合成的，然后剪切形成活性形式；

c)剪切异构体：同一基因经不同剪切方式可能产生不同大小的蛋白；

d)多聚体：比如蛋白二聚化；

e)电泳，胶浓度，蛋白Marker等因素也会影响是实际蛋白分子量的判断。

如何提高上样量？

1)可以浓缩样品；或增大上样体积来增大上样量；

2)用5X的上样缓冲液来稀释变性。

转膜注意事项？

1)滤纸、胶、膜之间的大小，一般是滤纸≥膜≥胶。

2)滤纸、胶、膜之间千万不能有气泡，气泡会造成短路。

3)保持膜的湿润，若FVDF膜干燥，需要重新用甲醇活化

为什么Western blot 背景高？

1)膜封闭不够-延长封闭的时间，可以选择快速封闭液

（如碧云天的P0252 QuickBlock Western封闭液为进一步提高信噪比，推荐同时使用QuickBlock Western一抗稀释液(P0256)和QuickBlock™ Western二抗稀释液(P0258)进行一抗及二抗的稀释。）

2)一抗稀释度不适宜-对抗体进行滴度测试，选择适宜的抗体稀释度

3)检测时曝光时间过长-调整合适的曝光时间。

为什么条带形状不好看？

1）胶凝的不均匀或聚合不好，建议灌胶前将溶液充分混匀

2）某些样品盐浓度较高，建议除盐或将样品盐浓度调成一致

3) 缓冲液陈旧，成分改变,可以重配

4) 凝胶下面有气泡,电泳前要先将气泡赶走

5）电泳时温度过高，可以降低电流或电压

6）样品中含有不溶性颗粒，建议样品充分搅拌混匀

为什么蛋白条带位置（大小）不对？

1）胶浓度不对，不同浓度的胶跑出的蛋白条带的位置可能有所偏差，可以调整浓度

2）抗体孵育不充分,建议增加抗体浓度，延长孵育时间

3）酶失活，建议直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物

4）目的蛋白存在翻译后修饰或剪切体，建议查询相关文献确定

5）标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低，建议设置阳性对照比对结果，增加标本上样量

WB实验中其他常见的问题

可能出现问题	原因	参考解决方案
相同蛋白杂交出现大小不均匀条带	制备凝胶时凝胶凝固太快，致使泳道中丙烯酰胺的比例不均匀	调整促凝剂的用量
目的条带染色过高/过低	分离不彻底	分子量大的蛋白用低浓度胶，分子量小的蛋白用高浓度胶
深背景出现白色条带	一抗或二抗加入过多	稀释抗体的浓度
背景有黑色斑点	抗体结合了封闭剂	过滤封闭剂
背景有不均匀的白色斑点	转膜时膜上有气泡或抗体在膜上分布不均	转膜过程中尽量去除气泡，抗体孵育时保持摇动