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共聚焦实验中培养耗材的选择
来源: | 作者:百菱生物 | 发布时间: 1758天前 | 4763 次浏览 | 分享到:

激光共聚焦显微镜可以观察到细胞内已经标记好的蛋白质和分子,为生物学研究提供了更直观的观测方法。如今,激光共聚焦成像已经是一个非常常规的实验操作,应用于生物学各个研究领域中。
在细胞实验中,如果要进行一次激光共聚焦成像,除了要知道相关的显微镜参数设置和操作以外,样品的准备也是非常重要的一环。


1.传统方法:


由于激光共聚焦实验对观测耗材的底部有着比较高的要求,普通的培养皿,培养板或者培养瓶都不能直接用于激光共聚焦成像。

  1. 比较常用的是使用170μm左右厚度的盖玻片作为激光共聚焦成像的细胞载体。但是使用盖玻片,在实验操作上是非常麻烦的,如果买的是国产的盖玻片,首先要做的一步是将盖玻片清洗并且烘干灭菌,才能开始使用。

  2. 细胞爬片,虽然不需要清洗,但是还是需要进行包被才能让细胞正常贴壁生长。通常是将处理好爬片直接放在多孔板中,然后铺细胞,荧光染色后,再用镊子将爬片拿出,反过来放在滴有封片剂(甘油配置)的载玻片上,再进行成像。如图一所示:


图一:使用盖玻片和细胞爬片的做免疫荧光方法示意图。

耐思细胞爬片

2.无需爬片的新方法:
这里要介绍的新方法,大大简化了样品准备流程,需要用到专为共聚焦实验设计的共聚焦培养皿。共聚焦培养皿的底部
为0.16-0.19mm的硼硅酸盐玻璃,结合了标准培养皿/板的便利性和盖玻片的成像优势,可提供高倍放大显微镜及共聚焦图像分析所需的最佳光学特性





耐思玻底培养皿/板
所有的操作都在培养皿中进行,不再需要镊子以及繁琐的清洗,灭菌,包被程序(流程如图二所示)


图二:共聚焦专用培养皿的准备样品流程,可以直接进行细胞培养-染色-成像操作


操作流程:

  1. 在超净台中打开共聚焦专用培养皿的灭菌包装,拿出培养皿,加入细胞悬液,盖上皿盖,放入培养箱中静置,等待细胞贴壁。常规细胞培养,待细胞长置合适密度再取出,进行免疫荧光染色。

  2. 吸出培养基,以PBS清洗细胞,再用2%的多聚甲醛PBS溶液固定细胞。

  3. 20分钟后,吸出固定液,加入0.1%Triton X-100

  4. 10分钟后,吸出Triton,清洗细胞后加入BSA封闭。

  5. 加入抗体荧光染色后,吸出所有试剂,加入封片剂,可以开始共聚焦显微成像。

 

 方法优势总结:

使用共聚焦培养皿还有个好处:往往一个共聚焦扫描成像持续时间很长,培养皿中的液体非常容易挥发,共聚焦培养皿有皿盖,可以减少挥发。

  1. 一个培养皿完成细胞培养-染色-成像等系列操作,无需包被,无需爬片,操作简便;

  2. 在培养皿里的操作对于操作技术的要求相对更低,也更便捷;

  3. 培养皿可使用皿盖减少蒸发,杜绝挥发对成像的影响。