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Cap 1 Capping System(Cat. No.:M082)

Cap 1 Capping System(Cat. No.:M082)

  • 牛痘病毒加帽体系利用牛痘病毒加帽酶及相关组分，将7-甲基鸟苷帽结构（m7Gppp，Cap0）加到 RNA 的 5´ 末端。在真核生物中，该结构与mRNA的稳定、转运和翻译密切相关。使用酶促反应为RNA加帽是一种简单有效的方法，且帽结构与天然Cap 0结构完全一致，能显著改善用于体外转录、转染和显微注射的RNA的稳定性和翻译能力。这种酶由两个亚基（D1和D12）组成，D1亚基执行RNA三磷酸酶和鸟苷转移酶的功能，D12亚基执行鸟嘌呤甲基转移酶的功能，它们对于添加一个完整的Cap 0结构m7Gppp5´N都是必须的（图1）。

  • 由牛痘病毒加帽酶构建的带帽RNA产品具有“cap 0”结构。通过在加帽反应中同时使用mRNA Cap 2'-O-甲基转移酶和牛痘病毒加帽酶，Cap 0-RNA可以转化为“ cap 1”结构。 mRNA Cap 2'-O-甲基转移酶通过将甲基从供体分子SAM转移到cap 0- RNA 5’端紧邻帽结构的第一个核苷酸的2'-O位置，从而从Cap 0-RNA制备Cap 1-RNA。

  • 本体系可用于IVT RNA的加帽反应，使加帽反应在1h之内完成，效率接近100%，并且保证正确的方向。IVT推荐使用近岸蛋白质T7 High Yield RNA Transcription kit（货号：E131）。


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商品描述

  • 牛痘病毒加帽体系利用牛痘病毒加帽酶及相关组分，将7-甲基鸟苷帽结构（m7Gppp，Cap0）加到 RNA 的 5´ 末端。在真核生物中，该结构与mRNA的稳定、转运和翻译密切相关。使用酶促反应为RNA加帽是一种简单有效的方法，且帽结构与天然Cap 0结构完全一致，能显著改善用于体外转录、转染和显微注射的RNA的稳定性和翻译能力。这种酶由两个亚基（D1和D12）组成，D1亚基执行RNA三磷酸酶和鸟苷转移酶的功能，D12亚基执行鸟嘌呤甲基转移酶的功能，它们对于添加一个完整的Cap 0结构m7Gppp5´N都是必须的（图1）。

  • 由牛痘病毒加帽酶构建的带帽RNA产品具有“cap 0”结构。通过在加帽反应中同时使用mRNA Cap 2'-O-甲基转移酶和牛痘病毒加帽酶，Cap 0-RNA可以转化为“ cap 1”结构。 mRNA Cap 2'-O-甲基转移酶通过将甲基从供体分子SAM转移到cap 0- RNA 5’端紧邻帽结构的第一个核苷酸的2'-O位置，从而从Cap 0-RNA制备Cap 1-RNA。

  • 本体系可用于IVT RNA的加帽反应，使加帽反应在1h之内完成，效率接近100%，并且保证正确的方向。IVT推荐使用近岸蛋白质T7 High Yield RNA Transcription kit（货号：E131）。


产品描述

  • 牛痘病毒加帽体系利用牛痘病毒加帽酶及相关组分，将7-甲基鸟苷帽结构（m7Gppp，Cap0）加到 RNA 的 5´ 末端。在真核生物中，该结构与mRNA的稳定、转运和翻译密切相关。使用酶促反应为RNA加帽是一种简单有效的方法，且帽结构与天然Cap 0结构完全一致，能显著改善用于体外转录、转染和显微注射的RNA的稳定性和翻译能力。这种酶由两个亚基（D1和D12）组成，D1亚基执行RNA三磷酸酶和鸟苷转移酶的功能，D12亚基执行鸟嘌呤甲基转移酶的功能，它们对于添加一个完整的Cap 0结构m7Gppp5´N都是必须的（图1）。

  • 由牛痘病毒加帽酶构建的带帽RNA产品具有“cap 0”结构。通过在加帽反应中同时使用mRNA Cap 2'-O-甲基转移酶和牛痘病毒加帽酶，Cap 0-RNA可以转化为“ cap 1”结构。 mRNA Cap 2'-O-甲基转移酶通过将甲基从供体分子SAM转移到cap 0- RNA 5’端紧邻帽结构的第一个核苷酸的2'-O位置，从而从Cap 0-RNA制备Cap 1-RNA。

  • 本体系可用于IVT RNA的加帽反应，使加帽反应在1h之内完成，效率接近100%，并且保证正确的方向。IVT推荐使用近岸蛋白质T7 High Yield RNA Transcription kit（货号：E131）。

图例：参与mRNA加帽的酶促途径。Cap 0结构RNA的产生需要牛痘病毒加帽酶：该酶兼具三磷酸酶、鸟苷转移酶和鸟嘌呤甲基转移酶的功能。其中S-腺苷甲硫氨酸（SAM）是甲基供体。一旦产生了Cap 0结构，就可以通过2'-O-核糖甲基转移酶进一步修饰以产生Cap 1结构。本图引自Michael Beverly , Amy Dell, Parul Parmar, Leslie Houghton et al (2016). Label-free analysis of mRNA capping efficiency using RNase H probes and LC-MS. Anal Bioanal Chem.
产品用途

  • 体内或体外翻译前mRNA的加帽和mRNA的5’末端标记。

  • 提高RNA的翻译效率；

  • 改善mRNA在显微注射和转染后的表达。

保存条件
-20℃保存，收到后请立即分装以避免反复冻融
质量控制
无大肠杆菌DNA残留、无核酸内、外切酶残留及RNA酶残留。
注意事项

  • SAM： SAM在pH 7-8，37°C条件下不稳定，为避免SAM降解，该工作液需要保存于冰上。

  • RNA：在加帽体系使用之前，应将体外转录反应产生的RNA进行纯化并溶解于RNase-free水中，不能将RNA溶解在EDTA溶液或其他盐溶液中。

  • RNA二级结构：一些RNA转录本可能形成稳定的二级结构（同源二聚体和发卡结构），如二级结构发生在转录本的5'端会影响加帽效率。在与加帽酶反应之前加热RNA可以去除转录产物5´端的二级结构，如果转录产物的5´端结构复杂，可以把加热时间延长至10min，加帽反应时间可延长至60min。

  • Cap 0-和Cap 1-mRNA：Cap 0-和Cap 1-mRNA之间的差异在RNA 5'端紧邻帽结构的第一位核苷酸（N1）是否具有2'-O-甲基。在高等真核细胞中，该甲基化是天然加帽过程的一部分，Cap 1结构提高了mRNA的翻译效率。

  • Poly(A) 尾：如果加帽的RNA需要添加3'-poly(A)尾巴，可以使用近岸蛋白质E. coli Poly(A) Polymerase（货号：M012）进行加尾。加帽和加尾后的RNA需在进行RNA转染实验前做纯化处理。

  • RNase Inhibitor：在配置反应体系时，可以加入0.5 µl近岸蛋白质RNase 抑制剂（货号：E125），同时去掉等体积的RNase-free水。

疑难解答

  • 1. 加帽效率低有哪些原因及解决方法？

  • 1) 在加帽反应之前，应将IVT产生的RNA纯化去除残留蛋白质，污染物和未结合核苷酸，并溶解在RNase-free水中，不能将RNA溶解在EDTA或其他盐溶液中；

  • 2) SAM在室温下会慢慢降解，需始终放置在冰上，由于SAM的降解导致的N7甲基化效率低，会进一步导致加帽失败；

  • 3) 可以适当增加RNA热变性的条件，把加热时间延长至10min，加帽反应时间可延长至60min；

  • 4) 某些RNA会在5'末端形成稳定结构（如同源二聚体，发卡结构），限制加帽酶靠近。分析序列后可以将RNA变性温度增加。如5'末端高度结构化，需要通过分子生物学技术来修改序列。通常可以通过在转录RNA（非编码区）的DNA模板前5个碱基中进行单点突变来实现。

  • 2. 缓冲液出现白色沉淀如何解决？

  • 1) 将反应缓冲液在37℃孵育5min，彻底混匀以溶解沉淀物；

  • 2) 不要将试剂盒储存于-70℃。

仅供科研或生产使用，不可直接应用于人体。