此文章转载自:莫纳生物
小伙伴们大家好！上一期带大家了解了酶的发现、逆转录过程和逆转录酶 M-MLV 与 AMV 的区别。
今天，将为您带来逆转录酶系列第二部分——逆转录酶的 RNase H 活性和热稳定性。
一般情况下，病毒的逆转录酶会连接一个 RNase H 活性结构域。RNase H 活性可能会与逆转录酶的活性聚合酶相互竞争 RNA 模板，在 cDNA 合成过程中同时切割 RNA : cDNA 杂合链中的 RNA 模板。因此在全长逆转录完成之前RNA 模板很有可能被降解掉。为了更好地合成 cDNA，提高逆转录效率，会在逆转录酶的 RNase H 结构域中引入突变，从而使逆转录酶的 RNase H 活性降低甚至完全消除。这种突变常常可以增加长链 cDNAs 的产量，促进其合成。所以在长片段 cDNA 合成过程中 RNase H 活性是必须要考虑且是需要规避掉的因素。
cDNA 合成过程中逆转录酶中的 RNase H 活性
RNA 是由核糖核苷酸经磷酸双酯键缩合而成长链状分子。与 DNA（脱氧核糖核酸）不同的是，RNA 一般为单股长分子，但在一般水溶液中会形成分子内双螺旋结构。此外，RNA 本身也需要通过碱基配对原则形成一定的二级结构乃至三级结构来行使生物学功能。RNA 的碱基配对规则基本上和 DNA 相同，不过其中尿嘧啶在配对上的作用，相当于 DNA 中的胸腺嘧啶。
在逆转录过程中通常需要高温使 RNA 成单链状态，升高反应温度有助于坚固二级结构和/或高 GC 含量的 RNA 变性，使得逆转录酶能够更好的读取序列。因此逆转录酶耐受高温的能力是 cDNA 合成的重要影响因素。在反应温度较高的情况下，逆转录能够实现全长 cDNA 合成，产量更高，进而使 RNA 能够更好地逆转录为 cDNA 。野生型 AMV 的 RNase H 活性较高，cDNA 合成率较低。而野生型 M-MLV 的 RNase H 活性较低，并且 cDNA 合成率较高，这点满足逆转录酶的需求。但它也有热稳定性差，抵抗二级结构能力弱的缺点，而这些缺点我们可以经过基因工程改造来弥补不足。为了提高 MMLV 逆转录酶的热稳定性，Aurimas 等人采用了区划核糖体展示技术（CRD）鉴定了 D200N、L603W、T330P、L139P、E607K 等高持续合成能力和耐热稳定性的多突变MMLV逆转录酶变体。这种高度耐热的逆转录酶特别适用于从富含 GC 的 RNA 模板 合成 cDNA。因此，RNase H 活性较低、可耐高温的 MMLV 逆转录酶是更好的选择。通过了解逆转录酶 RNase H 活性和热稳定性的特性，大家对逆转录酶有了更深层次的了解，对于如何选择逆转录酶，自己初步有一定的判断了。下一期我继续带大家了解逆转录酶持续合成能力、保真度和末端核苷酸转移酶（TdT）活性对逆转录的影响，让大家全方位了解逆转录酶，大家敬请期待吧！
大幅提升了逆转录效率和 RNA 复杂二级结构的耐受性，特异性更好、产率更高、更容易获得全长 cDNA，最长可达 12kb
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参考文献
[1] Retroviruses [J]. Telesnitsky A,Goff SP.Cold Spring Harbor Laboratory Press.1997
[2] Mechanistic implications from the structure of a catalytic fragment of Moloneymurine leukemia virus reverse.transcriptase [J].Georgiadis MM, Jessen SM, Ogata CM, Telesnitsk A, Goff SP, Hendrickson WA . Structure. 1995(9):879-892
[3] Generation and characterization of new highly thermostable and processive M-MuLV reverse transcriptase variants [J]. Baranauskas A, Paliksa S, Alzbutas G, Vaitkevicius M, Lubiene J, Letukiene V, Burinskas S, Sasnauskas G, Skirgaila R. Protein Engineering, Design & Selection vol. 2012(25): 657–668
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