干货课堂 | qPCR 样品前处理
来源:
|
作者:百菱生物
|
发布时间: 888天前
|
3474 次浏览
|
分享到:
qPCR，即 Real Time PCR，也被称为实时荧光定量 PCR，是实时荧光定量核酸扩增检测系统。上一期我们讲了 qPCR 的学术用语和数学原理，这一期我们主要讲 qPCR 的样品前处理。
qPCR，即 Real Time PCR，也被称为实时荧光定量 PCR，是实时荧光定量核酸扩增检测系统。上一期我们讲了 qPCR 的学术用语和数学原理，这一期我们主要讲 qPCR 的样品前处理。样品采集是造成试验差异的第一个潜在来源，特别是对检测 RNA 的试验。
RNase（Ribonuclease，核糖核酸酶）是一类能够催化 RNA 降解为小分子 RNA 的核酸酶，广泛存在于真核生物、原核生物的所有细胞和组织中，通常具有极强活性，RNA 样本中微量的 RNase 污染，就足以导致 RNA 样本完全降解。
对于外源性污染源，就需要在操作细节上注意，应该使用 RNase free 耗材，高温或 DEPC 处理的器皿，使用 RNA 实验专用试剂，操作时戴口罩、手套，设置 RNA Free 工作区，避免交叉污染。
对于内源性污染源，就需要在材料处理与保存方面注意。将材料保存在冰箱或者液氮中能够很好的维持材料中核酸的稳定性。有条件的情况下应该立即提取或者液氮速冻。
RNA 的纯度会影响 cDNA 的合成量，所以在提取 RNA 后需要进行 RNA 纯度和质量检测。RNA 中的蛋白质等有机物污染程度用 OD260/ OD280 来表示。
①1.8 < A260/280 < 2.0 为 RNA 质量较好，符合要求。
②当 A260/ 280 < 1.8 时：表示蛋白或者其他有机物的污染比较明显。
③当 A260/ 280 > 2.2 时：表示 RNA 已经水解成单核酸。
莫纳的超微量核酸蛋白检测仪，有全波长，三种光程，样品检测浓度范围大，有微量检测和比色皿两种检测模式，操作简单，可快速检测核酸、蛋白质和细胞溶液。
RNA 完整性采用琼脂糖凝胶电泳的方式进行检测。
完整的总 RNA 在进行琼脂糖凝胶电泳时会产生清晰的 28S 和 18S rRNA 条带（真核样品）。28S rRNA 条带的强度应当大致为 18S rRNA 条带的两倍。这种 2:1 的比率（28S：18S）是判断 RNA 完整性的一个很好的指标。最下面可能有淡淡的条带 5.8S tRNA 等。如果观察到有条带大于 28S，就说明样品中可能有基因组 DNA 的污染，这时候就需要使用 DNase I 进行处理。
Luna凝胶成像系统
RNA 提取时，最值得注意的就是基因组 DNA 的污染物。那何时去除基因组 DNA 污染？一种是在 RNA 提取过程中去除，还有一种是在逆转录反应之前去除。
为什么要去除基因组 DNA 的污染呢？如下图，反应 3 是去除基因组进行逆转录的实验结果，反应 4 是去除基因组不进行逆转录的实验结果，反应 3 和反应 4 的结果就是正常的实验结果。但是我们看反应 1 和反应 2，他们分别是不去除基因组进行逆转录和不去除基因组不进行逆转录的实验结果，发现他们两个在所做的荧光定量实验中都检测出了信号。由此可看出，基因组 DNA 的残留对 qPCR 结果会造成很严重的影响。所以我们在实验中应该尽可能的把基因组 DNA 去除掉，从而保证我们数据结果的准确性。
逆转录酶的反应温度是关键，高温有利于逆转录反应，有助于全长 cDNA 的合成，获得完整的 cDNA 产物。
对于 37/ 42℃ 常规孵育来说，复杂的 RNA 模板二级结构未充分打开，从而阻碍了 cDNA 的合成。在 55℃ 高温孵育的条件下，复杂 RNA 模板二级结构在高温下会充分打开，因此 cDNA 的合成会继续。
因此我们要选择：逆转录反应温度更高的产品进行 cDNA 的合成！
有更高逆转录反应温度：逆转录反应温度最高可达 55℃，获得 cDNA 产量更高，具有更完整的基因代表性，较低 RNase H 活性。
大幅提升了逆转录效率和 RNA 复杂二级结构的耐受性，特异性更好、产率更高、更容易获得全长 cDNA。
两步法是分两步进行，就是反转录反应和qPCR两个反应，先完成反转录，反转录引物为通用引物，后以cDNA为模板进行后续qPCR检测。
一步法是反转录反应和qPCR反应在同一反应管内连续进行，先完成反转录，反转录引物为基因特异性引物（GSP），然后直接进行扩增，得不到cDNA。一步法操作简单，污染几率低。
适用范围：基因表达解析等目的基因数多，样品数少，适合两步法；病毒、病原菌检测，样品数多，适合一步法。
莫纳生物一步法与两步法产品区别
这一期就到这里，下一期琴子为大家讲解 qPCR 的引物设计，大家敬请期待吧！
如您有购买意向，欢迎致电我们的代理商或销售人员！
联系我们
电话：020-29842979
QQ:1164119484、1740588570
邮箱：sales@gzbiolink.com
网址：www.gzbiolink.com
