实验技术 | PCR实用tips 请查收！
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作者:百菱生物
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发布时间: 878天前
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PCR（Polymerase Chain Reaction）是1983年由Kary Mullis发明，至今仍广泛使用的DNA扩增技术。它通过高温解链、低温退火、中温扩增的过程，来实现目标片段DNA的指数级扩增。
此文章转载自：无锡耐思NEST
PCR（Polymerase Chain Reaction）是1983年由Kary Mullis发明，至今仍广泛使用的DNA扩增技术。它通过高温解链、低温退火、中温扩增的过程，来实现目标片段DNA的指数级扩增。
PCR反应体系可以简单概括为三部分：DNA模板（Template）、引物（Primer）及DNA聚合酶预混液（PreMix，MasterMix等），其中商业化的DNA聚合酶产品预混液已包括浓度优化过的DNA聚合酶、三磷酸核苷（NTPs）、Mg2+、缓冲液及惰性染料等，可以根据实验需要选择扩增速度、保真性不同的DNA聚合酶以及预混染料的产品。整个体系经常为20μL或50μL的体积，可置于0.1mL或0.2mL的PCR管中。
PCR热循环仪是实现PCR反应的外部硬件，按照设定的反应程序，利用金属浴来按时加热、冷却PCR反应体系来完成解链、退火和扩增的过程。温度和时间的设定受引物Tm（DNA Melting Temperature，熔解温度）、目标序列长度及DNA聚合酶扩增速度影响。一个典型的PCR程序如下：
a)起始模板含量依据DNA类型及DNA聚合酶性质来决定。一般质粒DNA模板起始含量为0.1~1ng，基因组DNA以5-50ng为佳，例如25ng/μL的基因组DNA模板，加1μL左右就够了。过少的模板会降低得率，过多则会导致非特异性扩增。b)模板提取过程中，模板完整性受到损坏或提取试剂残留都可能会导致PCR反应失败。PCR反应出现不扩增或异常时，可以考虑用电泳检验DNA完整性以及使用Nanodrop测定DNA纯度来排除问题。a)引物设计对长度、碱基构成、序列有很多限制，但目前很多软件都可以辅助引物设计来规避可能出现的问题。扩增引物和用于引入点突变的引物都可以借助软件来设计。b)引物终浓度需要控制在适配DNA聚合酶的范围内，实际使用时可以将上下游引物预混直接加入，减少时间及枪头成本哦。一定要用不含DNA酶（DNase-free）的水，也可以预混到引物里面，算好浓度和体积就行，体系不足的体积都由水来补足。4. DNA聚合酶预混液
a)最后加入体系以保证对存货（stock）的最小污染，加完后可用枪头缓慢混匀。
b)直接上电泳的基因分型实验可以选择预混Loading buffer的DNA聚合酶，省去了很多加样的时间。
PCR结束后应尽量当天进行后续实验，或将产物置于4℃短期保存哦。
稀释系数tips：1）10X的溶液20μL体系中加2μL，2X的溶液20μL体系中加10μL；2）4X溶液与4X溶液等体积混合后为2X预混液（Premix）。
最后划重点，每次PCR实验时不要忘了包括阴性和阳性对照。
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