NK细胞作为先天免疫系统的关键成员，是抗肿瘤、抗病毒感染及免疫调节的核心力量。根据功能状态，NK细胞可分为静息态与激活态，激活态的增殖能力与细胞毒活性显著增强，是体外研究与应用的核心靶点。

本期细胞学堂将聚焦NK细胞的分离、激活、体外扩增、冻存和复苏策略，全套实操干货助力您一站式解锁实验关键技巧。

NK细胞是一类具有免疫防御功能的淋巴细胞，属于机体先天免疫系统的重要组成部分。其特点是可以在未受到特异性刺激的情况下，直接识别并杀伤病原体感染细胞或恶性肿瘤细胞。

图1. NK细胞杀伤机制示意图

图片来自参考文献：Consise Clinical Immunology for Healthcare Professionals

NK细胞的标志性表型为CD3^- CD56⁺。其中CD3标记用于区分CD3⁺ CD56⁺的NKT细胞。

根据CD56表达水平，NK细胞可分为2种不同功能差异显著的亚群。

●CD56^{^bright}亚型：CD56高表达，CD16低表达或不表达。

这类细胞主要分泌细胞因子（如IFN-γ、TNF-α）发挥免疫调节作用，增殖能力较强而杀伤靶细胞的能力较弱，主要参与抗病毒免疫的早期启动和免疫稳态维持。

●CD56^{^dim}亚型：低表达CD56而高表达CD16。

这类细胞具有较强的细胞毒作用，分泌细胞因子的能力较弱。通过CD16介导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）或自然杀伤作用发挥效应。

脐带血来源NK细胞的分离与培养流程与外周血基本一致，但因其初始比例较低，通常需更长扩增时间以获得足量细胞。以下以外周血来源NK细胞为例进行说明。

①将新鲜血液2,300 rpm离心10 min后，取上层血浆层，用PBS按1：1比例稀释。

②将稀释后的血液铺于Ficoll上方，2,000 rpm离心20 min，升速1降速0。

③ 离心结束后可见明显分层：上层是血浆、中间是透明分离液层、下层是红细胞/粒细胞层，分离液层和血浆层中间的细胞层是PBMC层（图2）。

图2. Ficoll分离液分离后示意图

④吸取细胞层（PBMC）至新离心管，用PBS清洗2-3次、每次1,200 rpm离心8 min，升1降0。

⑤PBS重悬后进行细胞计数。

① CD16抗体包被培养皿：将含有CD16可溶性抗体的包被液加入培养器皿中，置于4℃冰箱过夜孵育。

② 包被好的培养皿清洗2-3次，随后加入含有IL-2、IL-15等关键细胞因子的无血清培养基。

③将PBMC以2-2.5×10⁶/mL的密度接种到含无血清培养基的培养皿中，并置于37℃、5% CO₂培养箱中培养。

培养前期（约1周左右）可添加5%灭活的自体血浆，使细胞维持在一个更好的状态，提高细胞活率和增殖速度。

培养过程中每2天向培养基内补充NK细胞生长所需的因子和无血清培养基。并检测细胞密度，建议将细胞密度调整至1×10⁶/mL，以保证细胞属于良好的增殖状态中。

NK细胞的鉴定主要依赖流式细胞术检测其表面标志（CD3^- CD56⁺），并结合功能实验对其杀伤活性进行综合评估。功能评价常采用效靶比实验，通过设置不同比例的NK细胞与靶细胞，检测靶细胞裂解率，从而量化NK细胞的细胞毒能力。

建议使用含有10%DMSO的冻存液，保护细胞膜在低温下不受损失。

将离心收集的NK细胞用冻存液重悬，并调整细胞密度至1×10⁶/mL-1×10⁷/mL。

细胞悬液转移至冻存管后进行梯度降温，-80℃冰箱过夜后转移至液氮长期保存。

针对不适合使用含血清体系的实验需求，可选择无血清冻存液进行细胞冻存。

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在复苏时，需提前打开水浴锅，温度设定37℃，预热培养基。

取出冻存管，置于PE手套中，将PE手套浸泡在37℃水浴锅中，快速摇晃直至冻存液完全解冻。

将溶解后的细胞转移至有装有5 mL预热好的培养基的15 mL离心管中，经300 g离心5 min离心，去上清。

使用完全培养基重悬细胞，转移至准备好的培养皿内。

放入37℃、5% CO₂、饱和湿度的细胞培养箱中静置培养。

普诺赛^®提供的人源NK细胞（抗体-细胞因子激活扩增）呈典型聚团生长状态 （图3）。流式细胞术检测鉴定结果显示（图4），CD3^- CD56⁺细胞比例高于95%。在不同效靶比（E:T ratio)条件下，NK细胞对K562细胞表现出显著的细胞毒活性（图5）。

图3. 人源NK细胞明场图

图4. 流式细胞术检测NK细胞表面标志物CD3与CD56的表达

图5. 不同效靶比下NK细胞介导的细胞毒活性定量分析