基质胶使用常见问题与操作指南③｜一文搞定侵袭、成瘤、干细胞培养关键操作！
来源:模基生物
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作者:模基生物
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发布时间: 2天前
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一文搞定侵袭、成瘤、干细胞培养关键操作！
侵袭实验基质胶稀释比例是多少？
孵育后为什么底部没有基质胶凝固？
按照基质胶（082704/082706无酚红）：基础培养基=1：8比例稀释使用，当基质胶被稀释到小于3mg/mL时，无法清晰地观察到凝胶现象，只要在37°C环境进行孵育，基质胶会在底层形成薄层凝胶。
首先明确细胞是否具备侵袭能力和细胞状态。建议实验前用酶谱法检测基质金属蛋白酶(MMPs)的表达，特别是MMP-2的表达。为了让实验结果更明显，可在无血清的情况下，让细胞饥饿12-24h，再进行实验。
很可能是上室混有高浓度血清或者是小室孔径不对，建议核对小室的孔径；
确认基质胶的稀释比例：基质胶太厚或浓度过高导致阻力过大，细胞无法有效降解或穿透；建议标准型基质胶按照1：8比例稀释后使用。
肿瘤生长过程中，如果出现肿瘤块先缩小后变大的现象，很可能是由于炎症反应，肿瘤细胞被小鼠自身吸收造成的，如若后续肿瘤依旧未长出来，可考虑更换免疫缺陷程度更大的小鼠。
实验条件与操作确认要点（皮下成瘤实验）
实验条件确认：明确所用细胞系（肝癌、乳腺癌等细胞本身成瘤难度存在差异），确认细胞接种量，确认小鼠周龄
细胞状态确认：若细胞状态差、活力不足，建议复苏后传代2–3代再用于实验； 若肿瘤细胞不易成瘤，可添加基质胶辅助成瘤、提高接种细胞量或更换成瘤性更好的细胞系
小鼠周龄确认：小鼠周龄偏大易导致皮下成瘤失败，推荐使用4–6周龄小鼠。
基质胶使用确认：确认是否使用基质胶、使用的基质胶型号；一般建议选用高浓度基质胶（推荐型号：082724/082726）。
注射操作确认：确认注射手法是否规范，操作者是否具备皮下注射经验。
是的，裸鼠年龄过大可能会影响成瘤，因为年龄增大免疫反应增强，建议尽量使用推荐的4–8周龄裸鼠。
建议进行文献调研，如果是新细胞系首次在裸鼠皮下建模，可进行预实验确定合适的细胞数量。
基质胶铺板后，培养板底部出现类似烙状或丝状的物体，还伴有黑色点状物质，这是什么原因造成的呢？
出现这种情况，通常是因为铺板所用的培养板温度过高，或者培养板温度分布不均匀。当基质胶加入时，部分局部区域迅速凝固，而有些区域尚未凝固。在后续摇晃培养板的过程中，就容易产生丝状结构以及黑色点状物质。
解决方案：建议将六孔板放置在 -20°C 的环境中过夜预冷，之后再取出进行铺板操作。
取36 mL冷藏DMEM/F12或者Rhoi Free铺板液于50 mL离心管中，准备4个6孔板于-20度预冷过夜，标记基质胶、批号、日期和操作人。1 mL无菌枪头置于-20℃冰箱中预冷1小时，取出一支冷冻的基质胶(400 μL)置于碎冰中，再放入4℃冰箱解冻至完全化冻。准备一个装满碎冰的冰盒,将解冻过的基质胶、预冷的1mL枪头放置于生物安全柜上。
用预冷枪头将解冻过的基质胶(400 μL)加入冷的DMEM/F12并反复吹打解冻混匀。吸出已解冻混匀的基质胶加入离心管中，剩余的DMEM/F12使用10 mL移液管再次反复吹打混匀。分装1.5 mL/孔于4个六孔板中，轻轻摇晃混匀。培养板置于37°凝胶1小时后即可使用，或置于4℃冷藏过夜，两周内使用。
以上就是本期基质胶使用常见问题与操作指南③。
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